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Un tumor o varios tumores ?

Muchos habrán pasado por ello: tras obtener un diagnóstico mediante biopsia, el proceso o bien no responde al tratamiento correspondiente o bien no evoluciona de la forma esperable para lo que se supondría con ese diagnóstico.

Nuestra práctica de la medicina veterinaria cambiará a mejor el día que entendamos que muchas de las lesiones que hoy interpretamos como una entidad (diagnóstica, clínica, terapéutica,…) son en realidad la misma presentación pero para procesos distintos. Un ejemplo: en veterinaria todavía clasificamos las glomerulopatías en tal o cual glomerulonefritis (GN) según su morfología de la misma forma como se describían hace más de 60 años, pero en cambio nadie se sorprende por el hecho de que aquellos compañeros dedicados a la nefrología no hayan conseguido hasta ahora encontrar pautas precisas que correlacionen una determinada GN con una bioquímica concreta, un tratamiento efectivo y una evolución predecible.

En medicina humana ya hace tiempo que se reconocen formas diferentes de correlacion clínica, respuesta al tratamiento y pronóstico para una misma forma de GN porque al analizarlas a nivel transcriptómico se ha demostrado que un mismo tipo morfológico de GN puede representar nefropatías distintas. Es decir, el aspecto de lesión algunas veces no preve como se va a comportar realmente aquella lesión. Los autores de este trabajo nos presentan otro ejemplo paradigmático de esta situación pero en veterinaria: el linfoma B difuso de células grandes (LBDCG) en perros.

Uno o varios tumores

El LBDCG es el tumor linfoide más frecuente y agresivo en perros. Ahora bien, mientras que su diagnóstico ha evolucionado mucho en los últimos años, no ha sido así con las estrategias de tratamiento. Los animales con LBDCG pueden mostrar una evolución clínica, una respuesta al tratamiento y un pronóstico muy variables. Esta variabilidad es achacable en parte a aquellas características que se valoran a través de las técnicas de diagnóstico que aplicamos de forma convencional (morfología, clonalidad, citometría), y estas son el estado de activación de las células B, el índice mitótico y la extensión a sangre y médula ósea del tumor. Pero son particularidades del tumor que no explican el porqué de esta variabilidad. El escenario es distinto si el tumor se examina a nivel genómico.

Cuando se realizan estudios de expresión de genes en casos de LBDCG, se observa que el mismo tumor se subdivide en dos neoplasias distintas, una constituída por células típicas de los centros germinales (CG) y una segunda formada por células B activadas CBA), y la superviviencia de los pacientes con LBDCG-CG es distinta de aquellos con LBDCG-CBA, dando a entender que son entidades diferentes.

De forma similar, también se observan diferencias cuando se estudian cambios cromosómicos mediante hibridación genómica comparativa. Respoderán mejor al tratamiento aquellos perros con modificaciones en el cr13. Aquellos otros con una adquisición del cr31 tendrán peor pronóstico.

Y si se examina la metilacion del ADN (la metilación del ADN juega un papel fundamental en el desarrollo de tumores hematopoyéticos) mediante secuenciación por bisulfito, se comprueba que existe metilación aberrante de CpG en determinados genes reprimidos en casos de LBDCG (TFPI-2).

No estamos hablando de que un mismo tumor se comporte de una u otra forma en función de qué genes exprese. Lo que muestran estos resultados sugiere que el LBDCG es en realidad un conjunto heterogéno de neoplasias diferentes en lugar de un único tipo de tumor tal como lo vemos ahora. La medicina veterinaria se encuentra lejos de aplicar técnicas transcriptómicas, estudiar cambios cromosómicos y valorar la metilación del ADN en los tumores de nuestras mascotas como herramientas de diagnóstico rutina. Pero como mínimo podemos empezar a comprender el porqué de la variabilidad en la respuesta al tratamiento y en la evolución de algunas neoplasias aún siendo el mismo tumor. Sino entendemos que asociar el binomio «una lesión-una entidad» es un error, entonces nos seguiremos sorprendiendo siempre que suceda lo inesperado.

 

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1 + 2 + 3 = linfoma

Puede ser ganglio, bazo o intestino. Da igual. No pasa semana sin alguna biopsia de una lesión en uno de estos tejidos linfoides en la cual uno no es capaz de reconocer, sólo por medio de la histología, si lo que está viendo es o no es un linfoma. Y si resulta embarazoso para el patólogo más desconcertante será para el clínico que tendrá que asumir y explicar al propietario que la biopsia que acaba de practicar a su mascota no va a determinar por sí misma si lo que padece el animal es o no un linfoma.

Linfoma ocular

Linfoma ocular

La alterantiva en estos casos es echar mano de las pruebas inmunohistoquímicas o bien de las pruebas de clonalidad. Afortunadamente, la mayoría de casos podrán finalmente diagnosticarse con alguna de estos dos métodos. Pero cuando se propone al cliente qué elija una de las dos opciones (cada una tiene un coste y un período de realización distinto), lo habitual es que el veterinario no sólo no sepa cuál escoger sino que tampoco sabe que, en ocasiones, estas técnicas pueden seguir siendo no concluyentes, en especial por lo que se refiere a las pruebas de clonalidad.

Linfoma B. Inmunohistoquímica

Linfoma B. Inmunohistoquímica

Desde de que en los años 50 del siglo pasado Coons y Kaplan identificaron antígenos en tejidos marcando anticuerpos con fluoresceína, la inmunohistoquímica ha pasado a ser una técnica familiar en nuestra profesión. El diagnóstico de linfomas a través de una valoración de la homogeneidad del fenotipo mediante marcadores de inmunohistoquímica es una práctica habitual desde hace tiempo en la mayoría de laboratorios. Las pruebas de clonalidad, por el contrario, han irrumpido en la medicina veterinaria más recientemente y no sin cierta aureola de infalibilidad. El hecho de que la lesión se valore desde un punto de vista genético (en lugar de proteiníco) les confiere aparentemente ventaja sobre la inmunohistoquìmica. Pero no siempre es así.

Ya explicamos anteriormente el fundamento de las pruebas de clonalidad para diagnosticar linfomas (ver Pruebas de Pronóstico para Neoplasias 4. Linfomas). Aquí volvemos a hacerlo ahora pero de forma más sucinta, sólo para remarcar sus limitaciones y aclarar porqué pueden no ser a la panacea que diagnostique el tumor. Los veterinarios que se dedican a la clínica deberían conocerlas, saber que rango ocupan en la cadena de diagnóstico y saber que sus resultados no son incuestionables, especialemente si entran en contradicción con la clínica y otras técnicas más básicas. Entender su umbral de sensibilidad y especificidad es fundamental para el diagnóstico y el tratamiento del caso.

Saber cuando el resultado de una prueba de clonalidad es cuestionable es fundamental para el diagnóstico de un linfoma

El genoma de las células que forman una neoplasia es monoclonal porque toda la población tumoral deriva de una misma célula. Por el contrario, la presión que ejerce la inmunidad adaptativa da lugar a reordenamientos en los genes de los receptores de los linfocitos T (TCR) y B (Ig) que hacen que una hiperplasia o una inflamación sean policlonales. Así, considerando las posibles combinaciones de los fragmentos de los genes que codifican para estos receptores, en una situación de reactividad podrían existir 2 x106 linfocitos B con receptores Ig diferentes, 3 x 106 linfocitos T con receptores TCRab diferentes y 5 x 103 linfocitos T con receptores TCRgd diferentes. En un linfoma, por el contrario, todos los linfocitos tendrán el mismo reordenamiento. Serán monoclonales

Linfoma ocular

Linfoma ocular

En ocasiones, la biopsia no permite diagnosticar linfoma porque los cambios morfólogicos no son característicos. Puede suceder entonces que la inmunohistoquímica tampoco permita definir si la lesión es un linfoma porque no existe un predominio claro de alguno de los dos fenotipos. En estos casos, las pruebas de clonalidad ofrecen la posiblidad de establecer el diagnóstico obviando morfología y fenotipo, y valorando la homogeneidad (clonalidad) en el ordenamiento genético de estos receptores. La técnica se basa en una PCR que amplifica los genes de las regiones V y J que codifican para estos receptores mediante primers específicos. A priori, una técnica infalible que podría emplearse como primera opción de diagnóstico en lugar de la inmunohistoquímica o la biopsia. Pero la realidad no es así.

Las pruebas de clonalidad son una técnica que aporta información valiosa en diversas situaciones, pero a menudo se subestima su complejidad y los posibles errores de método, así como su dependencia de la experiencia del que la interpreta. La histología y la inmunohistoquímica no generan un resultado cerrado a modo de positivo-negativo, si-no, etc Dan lugar a un diagnóstico definitivo o, en caso contrario, aportan resultados que sugieren o descartan el diagnóstico en una u otra dirección. Es decir, no provocan falsos positivos o un falsos negativos. Por el contrario, las pruebas de clonalidad pueden distorsionar el diagnóstico porque generan una respuesta binaria: linfoma o no-linfoma. Y como veremos, en algunas situaciones detectan policlonalidad en casos de neoplasia (sensibilidad) y monoclonalidad en casos de reactividad (especificidad).

 

FALSOS NEGATIVOS: Las pruebas de clonalidad no detectarán monoclonalidad a pesar de tratarse de linfoma cuando

  1. Los primers emplados no son suficientemente específicos para los genes de los receptores
  2. Los primers son específicos pero no detectan clonalidad porque los genes de los receptores están mutados (hipermutación somática)
  3. La población de linfocitos no neoplásicos es superior a la de neoplásicos y la monoclonalidad queda ensombrecida por la policlonalidad.
  4. Los primers no detectan clonalidad por eliminación o desplazamiento de los genes de los receptores (aberraciones cromosómicas)

Ejemplos prácticos de estas situaciones son por ejemplo casos de linfoma intestinal en lo que las pruebas no detectan linfoma porque junto con el intestino se valora también ganglio mesentérico hiperplásico, o casos de linfoma cutáneo en los cuales tampoco se detecta neoplasia porque el tumor está infiltrado por una inflamación secundaria.

Si la clínica y la morfología son compatibles con linfoma, todas estas posiblidades deben sospecharse cuando las pruebas de clonalidad descartan linfoma.

FALSOS POSITIVOS: Las pruebas de clonalidad detectarán monoclonalidad sin ser linfoma cuando

  1. Determinados estímulos antigénicos (histiocitoma, hepatitis por reacción adversa, Ehrlichiosis, Leishmaniasis) favorecen la expansión de unos pocos clones dando la sensación de monoclonalidad.
  2. Se valoran muestras de bazo o médula ósea ricas en linfocitos TCRgd. Algunos clones de linfocitos TCRgd usan combinaciones de V/J sin deleciones ni inserciones que se traducen en monoclonalidad en poblaciones que son en realidad policlonales (reordenamiento canónico).
  3. Se amplifica de forma inespecífica regiones de ADN que no corresponden a los genes receptores de antígenos.

Ejemplos de falsos positivos son casos de pseudolinfoma y hepatopatía por reacción farmacológica en los cuales desaparece la monoclonalidad al retirar el fármaco, así como casos de histiocitoma.

Si la clínica y la morfología son sólo parcialmente compatibles con linfoma, todas estas posiblidades deben sospecharse cuando las pruebas de clonalidad confirman linfoma.

A pesar de su innegable utilidad, las pruebas de clonalidad no pueden verse como un método de diagnóstico en sí mismo. Ni tan si quiera son pruebas encaminadas a determinar el fenotipo de un linfoma (en algunos casos las células B reordenan locus de células T y lo mismo sucede al contrario, por lo que puede darse el caso de un linfoma B que exhiba monoclonalidad para T o un linfoma T que muestra clonalidad para B – infidelidad de linaje). El fenotipo de una neoplasia linfoide solamente se establece mediante la inmunohistoquímica.

Las pruebas de clonalidad son una herramienta de diagnóstico valiosa para aquellos casos en los que existe sospecha clínica de linfoma, la histopatología presenta lesiones sólo sugestivas de linfoma pero el caracter neoplásico de la expansión linfoide tampoco llega a poder establecerse aún cuando se valore el fenotipo predominante mediante pruebas inmunohistoquímicas. Nunca son la primera opción de diagnóstico y, en gran medida, dependen de la formación, la experiencia y el esfuerzo por integrarlas con otras técnicas por parte de quien las realiza. Deben entenderse como un eslabón más en la cadena de diagnóstico y supeditar siempre su interpretación a la clínica, la morfología y la inmunohistoquímica. No sólo esto, sino que su realización sólo se entiende si las histopatología y la inmunohistoqiimica han definifido previamente el objetivo a amplificar.

Clonality Testing in Veterinary Medicine: A Review With Diagnostic Guidelines

Veterinary Pathology 2016, Vol. 53(4) 711-725

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Barça vs R. Madrid

Cuando la histología no permite distinguir si una proliferación linfoide es reactiva (p.e. hiperplasia ganglionar linfoide, enteritis linfoplasmacítica, etc) o neoplásica (p.e. linfoma nodal, linfoma alimentario, etc), en el informe histopatológico proponemos y recomendamos realizar o bien técnicas inmunocitoquímicas o bien pruebas de clonalidad. El fundamento de estas pruebas ya se ha explicado en profundidad anteriormente en este blog (ver Pruebas Pronóstico (4). Linfomas). A pesar de ello, cuando el veterinario recibe el informe histopatológico, cuál es la diferencia entre ambas pruebas sigue siendo una pregunta habitual. Intentaremos explicar ahora en qué se diferencian estas técnicas con un ejemplo más ameno.

Imaginemos un equipo de fútbol como la selección española, integrado principalmente por jugadores del Real Madrid y del Barça, pero todos ellos vistiendo la misma camiseta de color rojo y al que vemos jugar desde la última gradería de manera que no podemos reconocer las caras de los jugadores. Un infiltrado linfoide al microscopio, en una tinción de rutina como la que aplicamos para el diagnóstico de biopsias, es algo semejante. Sólo vemos linfocitos azules, aún cuando sabemos con seguridad que la mitad de ellos pueden ser linfocitos T (p.e. Real Madrid) y la otra mitad linfocitos B (p.e. Barça). Como todas las neoplasias son monoclonales, para que ese equipo de fútbol representase una «neoplasia», no solamente deberían ser todos los jugadores de un mismo equipo (Barça o R. Madrid) sino que debería tratarse en los 11 componentes del equipo del mismo jugador. Spain's players (L to R) midfielder Serg

Sabiendo esto tenemos dos opciones para distinguir tumor de no-tumor. La opción A nos permite saber qué jugadores son del R. Madrid y qué jugadores son del Barça, pero no reconoceremos el jugador en concreto. Esto es la inmunocitoquímica. Es decir, mediante anticuerpos monoclonales frente a un antígeno (CD3) de los linfocitos T y un antígeno los linfocitos B (CD20), conseguiremos revelar si los linfocitos de ese infiltrado que afecta por ejemplo a la pared del intestino y que visten todos la camiseta roja son todos de un mismo equipo (p.e. R. Madrid) y por tanto es más probable que se trate de una neoplasia, en este caso un linfoma alimentario. Por el contrario, si la inmunocitoquímica revela que la mitad de los jugadores son del R. Madrid y la otra mitad del Barça, es decir mitad linfocitos B y mitad linfocitos T, en ese caso es seguro que no es una neoplasia sino una enteritis. Ahora bien, el hecho de que la inmunocitoquímica nos diga que todos son del Madrid o todos del Barça no nos asegura al cien por cien, viéndolo desde la última gradería, que se trate de un tumor porque seguimos sin ver la cara de los jugadores, sólo nos lo sugiere. Como hemos dicho antes, para que se trate de un tumor todo el equipo tiene que ser el mismo jugador.barça real madrid facebook i

La opción B es la valoración de la clonalidad. Aquí no marcamos la camiseta del Barça o del R. Madrid. Mediante PCR identificamos los jugadores en concreto y podemos saber si el equipo está formado por distintos jugadores (policlonal) y por tanto es una inflamación o bien por un único jugador (monoclonal) y por tanto es una neoplasia.

Y ahora viene la respuesta a la pregunta: ¿ que prueba elijo, inmunocitoquímica o clonalidad ? Solamente hay dos consideraciones: la especificidad que exijamos y qué coste estamos dispuestos a asumir. Saber solamente si son jugadores del Barça o del Madrid es más económico que saber si todo el equipo está formado por el mismo jugador, pero a la vez tiene más riesgo de interpretar el proceso como neoplasia cuando podría no serlo.

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Pruebas Pronóstico (4). Linfomas

PRUEBAS DE PRONÓSTICO PARA NEOPLASIAS (4) LINFOMAS

Análisis de reordenamientos de los genes Ig/TCR

La dificultad que supone diferenciar linfocitos neoplásicos de linfocitos reactivos hace que uno de los dilemas de diagnóstico más frecuentes, tanto para clínicos como patólogos, sean los linfomas en sus múltiples presentaciones y las leucemias linfocíticas. Una expansión de linfocitos reactivos (no neoplásicos) puede tener lugar a través de una infección, un trastorno autoinmune, por enfermedades genéticas que alteran la homeostasis de linfocitos y a través de ciertos tipos de neoplasia no linfoide.

Por poner algunos ejemplos prácticos del rompecabezas que supone distinguir una reacción linfoide de una neoplasia linfoide basta citar la proliferación de linfocitos granulares que puede observarse tanto en casos de leucemia como en infecciones por Ehrlichia canis; las efusiones torácicas linfoides que pueden sugerir tanto una efusión quilosa como un timoma o un linfoma mediastínico; los aspirados de bazo o ganglio con predominio de linfoblastos que pueden ser característicos tanto de un centro germinal normal o reactivo como de un linfoma; la similitud que presentan los linfomas indolentes en fases iniciales con una hiperplasia folicular linfoide; los casos de linfoma alimentario y una Enfermedad Inflamatoria Intestinal con las mismas características citológicas e histológicas; o los incrementos de células plasmáticas en médula ósea que pueden observarse tanto en el marco de infecciones como también en casos de mieloma. Todas estas analogías  inducen a emitir diagnósticos histopatológicos del tipo “…compatible con linfoma…” o “…sospecha de trastorno linfoproliferativo…”

Hiperplasia ganglionar reactiva

Hiperplasia ganglionar reactiva

 

Linfoma

Linfoma

Inmunofenotipaje

Un método aplicado hasta ahora en medicina veterinaria para solventar este problema ha sido la valoración de la diversidad linfoide mediante inmunofenotipaje. El inmunofenotipaje consiste en la determinación del tipo de  linfocito (p.e. linfocitos T, linfocitos B, linfocitos CD4+, linfocitos CD8, etc.) mediante inmunocitoquímica (marcaje de las células con anticuerpos monoclonales). El principio de diagnóstico de esta técnica se basa en el hecho de que una población linfoide homogénea fenotípicamente, es decir formada por un solo tipo de linfocito, es más sugestiva de una proliferación neoplásica que de una proliferación reactiva. Por el contrario, una lesión no neoplásica debería presentar una población linfoide de linaje heterogéneo.

El inmunofenotipaje presenta, sin embargo, dos importantes inconvenientes que limitan su eficacia. Los anticuerpos monoclonales disponibles en veterinaria y aplicables a biopsias para estudiar tipos de población linfoide se limitan a reconocer linfocitos T (anticuerpo CD3) y B (anticuerpo CD79), mientras que no existen marcadores para diagnóstico de rutina que permitan distinguir otras poblaciones y subpoblaciones de linfocitos. En segundo lugar, una población homogénea de un mismo tipo de linfocito no siempre es sinónimo de neoplasia, ya que puede tener lugar en casos de ehrlichiosis, leishmaniasis, peritonitis infecciosa felina, gastroenterocolitis, amiloidosis, etc. A la vez,  una neoplasia linfoide no siempre contiene una población homogénea de linfocitos, ya que cualquier linfoma nodal presenta en fases iniciales una población neoplásica homogénea mezclada con linfocitos normales residuales pertenecientes a otro linaje.

Linfoma B (CD79 positivo)

Linfoma B (CD79 positivo)

Linfoma T (CD3 positivo)

Linfoma T (CD3 positivo)

Determinación de la clonalidad de los genes Ig/TCR

Cuando la citología, la biopsia y el inmunofenotipaje no permiten emitir un diagnóstico definitivo de “neoplasia linfoide”, puede determinarse entonces la clonalidad de la lesión. La clonalidad en una proliferación linfoide se refiere a la variabilidad de la región del linfocito que reconoce un antígeno.

Una población de linfocitos reactivos reconoce una diversidad de antígenos y fracciones de antígeno, ya sean éstos ambientales, agentes patógenos e incluso autoantígenos. Por el contrario, los linfocitos neoplásicos, al derivarse de una única célula madre, siempre reconocen una misma fracción de antígeno. Esta diferencia viene definida por el reordenamiento de los genes que codifican para los receptores de antígenos.

Los genes VDJ codifican la región reconocedora de antígeno CDR3 tanto en los linfocitos B (fracción de unión al antígeno de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, Ig) como en los linfocitos T (receptor de células T g, TCR). Durante la maduración de los linfocitos, los genes de las regiones VDJ se recombinan de forma aleatoria, añadiendo nuevos nucleótidos (barra negra), lo cual genera amplificación de los genes.

Sin título

La proliferación linfoide de una muestra de biopsia puede analizarse a nivel molecular mediante PCR y primers con homología por las regiones conservadas de V y J, separando posteriormente el ADN mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida. La presencia de varios productos de ADN con distinto peso molecular indica diversidad de la región CDR3, es decir equivale a una población linfoide reactiva no neoplásica (policlonal) porque reconoce diversidad de antígenos. La presencia de un producto de ADN con un único peso molecular equivale a una población de linfocitos con un misma región CDR3, es decir una población neoplásica (monoclonal). Puesto que los primers son específicos para las regiones conservadas tanto de los genes de inmunoglobulina (linfocitos B, Ig) como del receptor de células T g (linfocitos T, TCR), el análisis del reordenamiento no sólo valora la clonalidad de la proliferación sino que, a la vez, también tipifica, en caso de linfoma, su eventual origen B o T. Es decir, en una misma prueba sabremos si es un linfoma y su pronóstico a través del tipo concreto de tumor.

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