Puede ser ganglio, bazo o intestino. Da igual. No pasa semana sin alguna biopsia de una lesión en uno de estos tejidos linfoides en la cual uno no es capaz de reconocer, sólo por medio de la histología, si lo que está viendo es o no es un linfoma. Y si resulta embarazoso para el patólogo más desconcertante será para el clínico que tendrá que asumir y explicar al propietario que la biopsia que acaba de practicar a su mascota no va a determinar por sí misma si lo que padece el animal es o no un linfoma.
Linfoma ocular
La alterantiva en estos casos es echar mano de las pruebas inmunohistoquímicas o bien de las pruebas de clonalidad. Afortunadamente, la mayoría de casos podrán finalmente diagnosticarse con alguna de estos dos métodos. Pero cuando se propone al cliente qué elija una de las dos opciones (cada una tiene un coste y un período de realización distinto), lo habitual es que el veterinario no sólo no sepa cuál escoger sino que tampoco sabe que, en ocasiones, estas técnicas pueden seguir siendo no concluyentes, en especial por lo que se refiere a las pruebas de clonalidad.
Linfoma B. Inmunohistoquímica
Desde de que en los años 50 del siglo pasado Coons y Kaplan identificaron antígenos en tejidos marcando anticuerpos con fluoresceína, la inmunohistoquímica ha pasado a ser una técnica familiar en nuestra profesión. El diagnóstico de linfomas a través de una valoración de la homogeneidad del fenotipo mediante marcadores de inmunohistoquímica es una práctica habitual desde hace tiempo en la mayoría de laboratorios. Las pruebas de clonalidad, por el contrario, han irrumpido en la medicina veterinaria más recientemente y no sin cierta aureola de infalibilidad. El hecho de que la lesión se valore desde un punto de vista genético (en lugar de proteiníco) les confiere aparentemente ventaja sobre la inmunohistoquìmica. Pero no siempre es así.
Ya explicamos anteriormente el fundamento de las pruebas de clonalidad para diagnosticar linfomas (ver Pruebas de Pronóstico para Neoplasias 4. Linfomas). Aquí volvemos a hacerlo ahora pero de forma más sucinta, sólo para remarcar sus limitaciones y aclarar porqué pueden no ser a la panacea que diagnostique el tumor. Los veterinarios que se dedican a la clínica deberían conocerlas, saber que rango ocupan en la cadena de diagnóstico y saber que sus resultados no son incuestionables, especialemente si entran en contradicción con la clínica y otras técnicas más básicas. Entender su umbral de sensibilidad y especificidad es fundamental para el diagnóstico y el tratamiento del caso.
Saber cuando el resultado de una prueba de clonalidad es cuestionable es fundamental para el diagnóstico de un linfoma
El genoma de las células que forman una neoplasia es monoclonal porque toda la población tumoral deriva de una misma célula. Por el contrario, la presión que ejerce la inmunidad adaptativa da lugar a reordenamientos en los genes de los receptores de los linfocitos T (TCR) y B (Ig) que hacen que una hiperplasia o una inflamación sean policlonales. Así, considerando las posibles combinaciones de los fragmentos de los genes que codifican para estos receptores, en una situación de reactividad podrían existir 2 x106 linfocitos B con receptores Ig diferentes, 3 x 106 linfocitos T con receptores TCRab diferentes y 5 x 103 linfocitos T con receptores TCRgd diferentes. En un linfoma, por el contrario, todos los linfocitos tendrán el mismo reordenamiento. Serán monoclonales
Linfoma ocular
En ocasiones, la biopsia no permite diagnosticar linfoma porque los cambios morfólogicos no son característicos. Puede suceder entonces que la inmunohistoquímica tampoco permita definir si la lesión es un linfoma porque no existe un predominio claro de alguno de los dos fenotipos. En estos casos, las pruebas de clonalidad ofrecen la posiblidad de establecer el diagnóstico obviando morfología y fenotipo, y valorando la homogeneidad (clonalidad) en el ordenamiento genético de estos receptores. La técnica se basa en una PCR que amplifica los genes de las regiones V y J que codifican para estos receptores mediante primers específicos. A priori, una técnica infalible que podría emplearse como primera opción de diagnóstico en lugar de la inmunohistoquímica o la biopsia. Pero la realidad no es así.
Las pruebas de clonalidad son una técnica que aporta información valiosa en diversas situaciones, pero a menudo se subestima su complejidad y los posibles errores de método, así como su dependencia de la experiencia del que la interpreta. La histología y la inmunohistoquímica no generan un resultado cerrado a modo de positivo-negativo, si-no, etc Dan lugar a un diagnóstico definitivo o, en caso contrario, aportan resultados que sugieren o descartan el diagnóstico en una u otra dirección. Es decir, no provocan falsos positivos o un falsos negativos. Por el contrario, las pruebas de clonalidad pueden distorsionar el diagnóstico porque generan una respuesta binaria: linfoma o no-linfoma. Y como veremos, en algunas situaciones detectan policlonalidad en casos de neoplasia (sensibilidad) y monoclonalidad en casos de reactividad (especificidad).
FALSOS NEGATIVOS: Las pruebas de clonalidad no detectarán monoclonalidad a pesar de tratarse de linfoma cuando
- Los primers emplados no son suficientemente específicos para los genes de los receptores
- Los primers son específicos pero no detectan clonalidad porque los genes de los receptores están mutados (hipermutación somática)
- La población de linfocitos no neoplásicos es superior a la de neoplásicos y la monoclonalidad queda ensombrecida por la policlonalidad.
- Los primers no detectan clonalidad por eliminación o desplazamiento de los genes de los receptores (aberraciones cromosómicas)
Ejemplos prácticos de estas situaciones son por ejemplo casos de linfoma intestinal en lo que las pruebas no detectan linfoma porque junto con el intestino se valora también ganglio mesentérico hiperplásico, o casos de linfoma cutáneo en los cuales tampoco se detecta neoplasia porque el tumor está infiltrado por una inflamación secundaria.
Si la clínica y la morfología son compatibles con linfoma, todas estas posiblidades deben sospecharse cuando las pruebas de clonalidad descartan linfoma.
FALSOS POSITIVOS: Las pruebas de clonalidad detectarán monoclonalidad sin ser linfoma cuando
- Determinados estímulos antigénicos (histiocitoma, hepatitis por reacción adversa, Ehrlichiosis, Leishmaniasis) favorecen la expansión de unos pocos clones dando la sensación de monoclonalidad.
- Se valoran muestras de bazo o médula ósea ricas en linfocitos TCRgd. Algunos clones de linfocitos TCRgd usan combinaciones de V/J sin deleciones ni inserciones que se traducen en monoclonalidad en poblaciones que son en realidad policlonales (reordenamiento canónico).
- Se amplifica de forma inespecífica regiones de ADN que no corresponden a los genes receptores de antígenos.
Ejemplos de falsos positivos son casos de pseudolinfoma y hepatopatía por reacción farmacológica en los cuales desaparece la monoclonalidad al retirar el fármaco, así como casos de histiocitoma.
Si la clínica y la morfología son sólo parcialmente compatibles con linfoma, todas estas posiblidades deben sospecharse cuando las pruebas de clonalidad confirman linfoma.
A pesar de su innegable utilidad, las pruebas de clonalidad no pueden verse como un método de diagnóstico en sí mismo. Ni tan si quiera son pruebas encaminadas a determinar el fenotipo de un linfoma (en algunos casos las células B reordenan locus de células T y lo mismo sucede al contrario, por lo que puede darse el caso de un linfoma B que exhiba monoclonalidad para T o un linfoma T que muestra clonalidad para B – infidelidad de linaje). El fenotipo de una neoplasia linfoide solamente se establece mediante la inmunohistoquímica.
Las pruebas de clonalidad son una herramienta de diagnóstico valiosa para aquellos casos en los que existe sospecha clínica de linfoma, la histopatología presenta lesiones sólo sugestivas de linfoma pero el caracter neoplásico de la expansión linfoide tampoco llega a poder establecerse aún cuando se valore el fenotipo predominante mediante pruebas inmunohistoquímicas. Nunca son la primera opción de diagnóstico y, en gran medida, dependen de la formación, la experiencia y el esfuerzo por integrarlas con otras técnicas por parte de quien las realiza. Deben entenderse como un eslabón más en la cadena de diagnóstico y supeditar siempre su interpretación a la clínica, la morfología y la inmunohistoquímica. No sólo esto, sino que su realización sólo se entiende si las histopatología y la inmunohistoqiimica han definifido previamente el objetivo a amplificar.
Clonality Testing in Veterinary Medicine: A Review With Diagnostic Guidelines
Veterinary Pathology 2016, Vol. 53(4) 711-725
